铜绿假单胞菌弹性蛋白酶基因的克隆及在昆虫细胞中的表达

以产弹性蛋白酶的铜绿假单胞菌基因组DNA为模板,经PCR扩增得到约1.5 kb的弹性蛋白酶基因,克隆到质粒pET28 a,连同其上游的6×H is序列转移到pBacPAK8构建成pBacPAK8-H is-E la转移载体。采用L ipofec-tin法,将载体pBacPAK8-H is-E la和亲本病毒BacPAK6共转染Sf21细胞,经空斑纯化分离得到重组病毒BacPAK6-E la。通过双酶切及单酶切鉴定证实弹性蛋白酶基因已插入到病毒基因组的多角体启动子下游,SDS-PAGE检测到在昆虫细胞中表达约34 kD的蛋白条带,以弹性蛋白为底物的生化反应证明了表达产物具有一定的生物学活性。研究结果为弹性蛋白酶的制备提供了新的方法。     

PCV2b Cap蛋白重组杆状病毒的构建及鉴定

猪圆环病毒(PCV)能够引起多种综合征和疾病,给养猪业造成了较大的经济损失。PCV2毒株在2003年后以PCV2b取代PCV2a成为临床感染的猪群中最为流行的基因型。PCV基因组为单股负链环状DNA,其中ORF2编码病毒核衣壳蛋白Cap蛋白,Cap蛋白是主要的免疫原性蛋白。本研究利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统将PCV2b的Cap蛋白基因克隆到杆状病毒载体中,通过制备杆粒、转染sf9细胞,获得表达PCV2b Cap蛋白的重组杆状病毒毒株,从IFA、SDS-PAGE及Western-blotting分析结果可以看出,该重组杆状病毒毒株成功表达了PCV2b Cap蛋白,为制备PCV2b Cap蛋白亚单位疫苗打下基础。     

Characterization of a nucleopolyhedrovirus variant of the gypsy moth,Lymantria dispar (Lepidoptera: Lymantriidae) in Turkey

The gypsy moth (Lymantria dispar L., Lepidoptera: Lymantriidae) is one of the most serious pest of various forestal, food and industrial crops worldwide. We have characterized a new Lymantria dispar nucleopolyhedrovirus (LdMNPV-T4) variant, which was isolated from dead L. dispar larvae in Turkey. Scanning electron microscope observations showed that the polyhedral occlusion bodies (OBs) of the LdMNPV-T4 were irregularly shaped. Transmission electron microscopy revealed that OBs of LdMNPV-T4 were occupied with several virions in which multiple nucleocapsids packaged by viral envelope. Restriction analysis of the LdMNPV-T4 DNA purified from the viral inclusion bodies yielded BamHI, BglII, EcoRI and HindIII fragments. The mean size estimated for the complete LdMNPV-T4 genome was calculated to be 163.3 kb. Phylogenetic analysis of amplified polh, lef-8 and lef-9 sequences showed its relation to the other NPVs from Lymantria species. Mortality values of the LdMNPV-T4 at four different concentrations against third instar larvae of L. dispar ranged from 45% to 88%. These results suggest that LdMNPV-T4 isolated from Turkey is a promising microbial control agent to be utilized for the biological control of L. dispar.     

家蚕细胞周期蛋白E(Cyc E)基因的2种剪切体克隆及其蛋白质的亚细胞定位

细胞周期蛋白E(Cyc E)是细胞从G1期转换到S期的重要调节因子。为了解家蚕Cyc E的功能,从家蚕BmN细胞中克隆了2种不同剪切方式的cyc E片段,分别命名为cyc E1173和cyc E837(GenBank登录号:HQ619696.1,HQ619697.1),将2种剪切体分别融合eGFP后利用杆状病毒系统在BmN和Sf9细胞中进行表达产物的亚细胞定位实验。家蚕cyc E的2种剪切方式的变化主要集中在第5～6外显子处。Cyc E1173和Cyc E837在2种细胞系中都定位于细胞核,但在Sf9细胞中存在Cyc E1173的荧光逐渐聚集到核膜及核心荧光弱化的现象,而在BmN细胞中,Cyc E1173和Cyc E837的荧光分布均匀,这种差异的原因可能与Cyc E出核降解相关。Western blotting检测在Sf9细胞中表达的Cyc E1173出现2条降解条带,而Cyc E837的融合蛋白并无这种降解情况,其可能的原因是cyc E1173和cyc E837之间存在表达产物降解水平上的差异,Cyc E1173更容易降解,推测其与细胞周期调控的关系更为密切。     

小反刍兽疫病毒H基因在杆状病毒中的表达

从小反刍兽疫病毒全长cDNA中对血凝素蛋白H基因进行特异扩增,回收PCR产物分别连接于T载体酶切及测序分析后,将其亚克隆至真核表达转移载体pFastBacHT,经重组筛选获得杆状病毒重组质粒。重组质粒转染sf9细胞后连续传3～4代,分别收获细胞上清及沉淀用于SDS-PAGE及Western blot对重组H蛋白的检测,用抗His蛋白单抗在细胞中检测到H标签蛋白,单抗在细胞及上清中检测到大小为46 ku的融合蛋白。     

中国对虾杆状病毒PCR扩增产物的DNA序列测定及分析

采用台湾报道的白点综合征相关杆状病毒的一对特异引物,对中国对虾的杆状病毒进行ＰＣＲ扩增,获得了预期的１４４７ｂｐ的扩增产物,将ＰＣＲ产物用ＱＩＡＥＸＩＩ纯化,直接进行序列测定。部分序列测定及分析结果表明,中国对虾的杆状病毒的部分ＤＮＡ序列与台湾ＷＳＢＶ的相关序列的同源性为９８．７％,经计算机分析该段基因序列有６个ＯＲＦ。该ＰＣＲ引物可以用中国对虾杆状病毒及其中相关病毒的检测与比较研究。     

中国对虾杆状病毒垂直传播途径的初步探讨

中国对虾杆状病毒垂直传播途径的研究对切断病毒的传播途径,培育健康的对虾种质资源,具有重要的理论和实践意义。本文利用电镜技术,对中国对虾亲虾的卵巢,卵细胞和无节幼体,溲状幼体,糠虾,仔虾,幼成虾进行病毒检测,结果发现卵巢和卵细胞中有似病毒粒子,无节幼体,糠虾,仔虾,幼成虾有杆状病毒感染,并初步探讨了中国对虾杆状病毒垂直传播的可能性。     

中国对虾（Penaeus chinensis）杆状病毒病的研究↑（*）

１９９３年养殖的中国对虾（ＰｅｎａｅｕｓＣｈｉｎｅｎｓｉｓ）发生了暴发性流行，经人工感染和电镜观察，证实是由杆状病毒引起的。病虾活力差。体色暗淡或微红，头胸甲上有浅黄色至白色的斑点，头胸甲与表皮下粘连，容易剥离，血淋巴混浊，淋巴器官和肝胰腺肿大，糜烂，在肝胰腺，淋巴器官，中肠，皮下组织和鳃等组织细胞的核内均发现有大量病毒粒子，病毒粒子杆状，无包涵体，具囊膜，平均长３５０ｎｍ，宽１５０ｎｍ，核衣壳体     

杆状病毒基因分子进化研究的新方法

利用基因组信息对病毒作进化分析是研究杆状病毒的基因组和分子进化的有效途径。通过比较杆状病毒基因组中基因的转录方向,建立了一种新的进化分析模式,并通过单个基因距离分析证实了此法的有效性。同时也介绍了杆状病毒基因组研究的新结果。